Anticorps à domaine unique
La mission de la plateforme Anticorps à domaine unique est d'aider les équipes de recherche à isoler des anticorps à domaine unique (aussi appelés VHH). Ces fragments de petite taille et compacts (13 kDa) correspondant aux domaines variables d'un sous-type d'anticorps de lama sont caractérisés par des propriétés exceptionnelles en termes de production, de stabilité et de propension à lier des épitopes enfouis inaccessibles aux anticorps conventionnels. La plupart des VHHs peuvent être exprimés sous forme de fragments solubles et actifs sans formation de ponts disulfures, dans un environnement réducteur tel que le cytoplasme ou le noyau cellulaire. Cette particularité permet leur utilisation comme outil intracellulaire pour neutraliser précisément une interaction spécifique d'une protéine cible sans interférer avec d'autres interactions de cette cible.
La plateforme réalisera des étapes d'immunisation de lama et de construction de bibliothèque.
Les étapes de sélection et de criblage, basées sur le phage display, peuvent être réalisées sur des protéines recombinantes, des cellules transfectées, des cellules intactes ou du lysat de lignées cellulaires. Les VHHs sont produits et purifiés à partir d'E. coli, et peuvent être fusionnés à divers tags (c-Myc, 6-His), modifiés avec une cystéine libre supplémentaire en C-terminal permettant une conjugaison dirigée à des nanoparticules, ou biotinylés in vivo.
Les gènes codant pour les VHHs peuvent également être fusionnés au gène d'une molécule rapporteuse telle que GFP, mRFP1. Les constructions résultantes peuvent être directement utilisées comme sonde dans les cellules vivantes ou pour la localisation de protéines.
La plateforme entièrement équipée (cycleur PCR à gradient, 3 hottes à flux laminaire pour l'affichage des phages, 2 hottes à flux laminaire pour la culture cellulaire, microincubateurs pour 15 plaques de microtitration, Tecan infinite M1000, cytomètre de flux (3 lasers, 8 couleurs), système de purification AKTA) peut accueillir des chercheurs, techniciens ou étudiants formés pour réaliser les différentes étapes une fois le projet validé.
Mission de la plateforme
La mission de la plateforme de sélection et de criblage d’anticorps à domaine unique est d’accompagner les équipes de recherche dans l’obtention de nanobodies d’intérêt : la sélection et le criblage des nanobodies peuvent être réalisés sur protéines recombinantes, cellules transfectées, cellules de lignées intactes ou extrait cellulaire par la technologie du phage-display.
Les nanobodies peuvent être produits dans E. coli avec différentes étiquettes (c-Myc, 6-His), avec une cystéine C-terminale permettant la fixation de nanoparticules, ou encore être directement biotinylés in vivo. Les gènes codant pour ces nanobodies peuvent aussi être fusionnés à des gènes codant pour des protéines fluorescentes (GFP, mRFP1, etc.). Ces constructions peuvent ainsi être directement utilisées comme sonde sur cellules vivantes.
Service et accessibilité de la plateforme
Banques « homemade » : la plateforme dispose déjà d’une quinzaine de banques obtenues à partir d’animaux immunisés avec :
• des protéines recombinantes
• des thymocytes humains
• des biopsies de divers cancers
• des cellules spécifiquement transfectées avec un récepteur
• des haptènes,
etc….
Banques « à façon » : après sélection de projets, la plateforme assure l’immunisation des lamas et la construction des banques permettant l’expression à la surface de bactériophage des Nanobodies.
Équipements
• PCR à gradient
• 3 PSM pour la sélection par phage display
• 2 PSM pour la culture cellulaire
• Microincubateurs de microplaques (capacité de 15 microplaques)
• Tecan infinite M1000
• Cytomètre (3 lasers, 8 couleurs)
• Système de purification AKTA
• Fermenteur de 15 litres
Labels, Financements et Partenaires
Comme d'autres, ils ont fait partie de l'équipe. Merci à tous ceux qui ont contribué à l'excellence et à l'impact du CRCM.
